SPE EXTRA Applikációk
Az adipokinetikus hormonok előtisztítása
Applikáció letöltése
Az adipokinetikus hormonok előtisztítása
Az adipokinetikus hormonok (AKH) a rovarok antistressz hormonjai, amelyek fenntartják a rovartest biokémiai és fiziológiai homeosztázisát (Kodrík, 2008). Az AKH-k okta-, nona- vagy dekapeptidek, amelyek mindkét végét blokkolja: az N-terminálist piroglutamát-maradék; a C-terminálist egy amid. Jellemzően specifikus antitestet és ELISA-módszert használnak mennyiségi meghatározására a rovarok központi idegrendszerében és a hemolimfában. Ez utóbbihoz az ELISA-teszt végrehajtása előtt több előtisztítási lépésre van szükség; szilárd fázisú extrakciós cartride-et is tartalmaznak. A teszt során a Pyrrhocoris apterus (Bodobács) AKH-ját alkalmazták, amely Pyrap-AKH néven ismert. Szerkezete: pGlu-Leu-Asn-Phe-Thr-Pro-Asn-Trp-NH2 (Kodrík et al., 2000).
Minta elválasztás – 160 pmol-Pyrap-AKH
Kontroll minta – 160 pmol-Pyrap-AKH
MSPE Módszer
| MSPE Oszlop: | Micro Spin SpeExtra™ column MSPE C18P 0.22μm Nylon membrane, 15 mg, 0.7 mL |
| Oldat A: | 0,11% trifluor-ecetsav (TFA) vízben |
| Oldat B: | 0,1% TFA 60% acetonitrilben |
| Centrifugálás: | 2000 rev/min |
| MSPE lépések: | 1. B oldat, 0,6 ml |
| 2. A oldat, 0,6 ml | |
| 3. Pyrap-AKH 160 pmol A oldatban, 0,6 ml | |
| 4. Az eluátumot ismét felvisszük a cartridge-ra, 0,6 ml | |
| 5. A oldat, 0,6 ml | |
| 6. Eluálás 0,3 ml B oldattal és 0,3 ml 100%-os acetonitrillel |
HPLC Módszer
| Oszlop: | Chromolith Performance |
| RP-18e oszlop 150 × 4,6 mm (Merck) | |
| Mobil fázis: | A = 0,11% TFA vízben, B = 0,1% TFA 60% acetonitrilben |
| Gradiens: | 0 – 2 perc 30 % B |
| 2 – 12 perc 30–90 % B, | |
| 12 – 15 perc 90 % B | |
| Áramlás: | 1.5 mL/perc |
| Detektálás: | Fluorescence, hullámhossz Ex 280 és Em 348 nm (Waters 2475 modell) |
Az alkalmazást a CAS Biológiai Központ, České Budějovice, Csehország fejlesztette.
Hivatkozások
Kodrík D. (2008) Adipokinetic hormone functions that are not associated with insect flight. Physiol. Entomol. 33: 171-180.
Kodrík D., Socha R., Šimek P., Zemek R. and Goldsworthy G.J. (2000) A new member of the AKH/RPCH family that stimulates locomotory activity in the firebug, Pyrrhocoris apterus (Heteroptera), Insect Biochem. Mol. Biol. 30: 489-498.
Cégünkről
Elérhetőségek
1087 Budapest,
Asztalos Sándor u. 5-6.
+36 30 922 85 18
+36 30 966 65 36
+36 20 491 72 54